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ras和Rb基因在肿瘤中的作用机制

责任编辑:tspsy-念暖发布于2019-10-21 16:58 浏览次

　　心理导读：20世纪80年代中期，癌症遗传学家已经看见成视网膜细胞瘤“黑幕”后面的阴影轮廓。遗传学家运用由珍妮特·罗利倡导的技术分析成视网膜细胞瘤癌细胞的染色体，证明了Rb基因“生活”在第13对染色体上。但是，一条染色体中包含了成千上万个基因。从这么巨大的基因集合中分离出单个基因，特别是一个只有失活时功能才会彰显的基因，似乎是一件不可能完成的任务。 ---www.tspsy.com

RAS和Rb基因在肿瘤中的作用机制

　　1983年，温伯格从癌细胞中提纯出突变的RAS的几个月后，雷·埃里克松因在src基因活动和功能方面的研究成果前往华盛顿，接受享誉全美的通用汽车奖。同时获奖的还有改善了白血病治疗方法的汤姆·弗雷。

　　这是一个辉煌灿烂的夜晚。在华盛顿宴会厅举办了一场高雅的烛光晚宴，然后是贺词和敬酒。科学家、医生和政界，包括许多从前的拉斯克派 ③在内，全都聚集在铺着亚麻桌布的桌旁。话题不时地转向致癌基因的发现和有疗效的化疗法的发明。但这两个话题似乎发生在彼此封闭孤立的不同星球，就像十多年前特明在休斯敦那场会议上的情况一样。弗雷因为治疗白血病而获奖，埃里克松则因为鉴定出重要致癌基因的功能而获奖，仿佛这两个奖项颁给了两个毫不相干的工作领域。埃里克松回忆道：“我不记得有临床医生热情地去与癌症生物学家接触，整合关于癌症这两极的知识。”癌症领域里病因和治疗各占半边天，不分彼此地接受了盛情款待，然后坐上各自的出租车，在夜色里分道扬镳。

　　RAS的发现帮助癌症遗传学家完成了一项挑战：他们已经从癌细胞中提纯出突变的致癌基因。但它同时也开启了另一个挑战。克努森的“二次突变假说”也制造了一个危险的预测：成视网膜细胞瘤的癌细胞包含了两个失活的Rb基因副本。温伯格、维格勒和巴巴西德已经证明瓦缪斯和毕晓普是正确的。现在，必须有人通过分离出传说中的“肿瘤抑制基因”，并证明在成视网膜细胞瘤中该基因的两个副本都已失活，来肯定克努森的预测。

　　但是，这个挑战同时也带来了一个在概念上奇特的扭曲。肿瘤抑制基因本质上就是因为它们的缺席而发生效用的。致癌基因发生突变时，为细胞提供一种“开启”信号使其生长。而与此对应的是，当肿瘤抑制基因产生突变时，会清除细胞生长的一个“关闭”信号。温伯格和施嘉和的转染实验之所以成功，是因为致癌基因可以引发正常细胞不受控制地分裂，因此形成了细胞的“灶”。但抗癌基因被转染进细胞后，却不可能指望它生成细胞的“反灶”。温伯格写道：“我们要如何才能捕捉到这些像幽灵一样躲在黑幕后面影响细胞的基因呢？”

　　20世纪80年代中期，癌症遗传学家已经看见成视网膜细胞瘤“黑幕”后面的阴影轮廓。遗传学家运用由珍妮特·罗利倡导的技术分析成视网膜细胞瘤癌细胞的染色体，证明了Rb基因“生活”在第13对染色体上。但是，一条染色体中包含了成千上万个基因。从这么巨大的基因集合中分离出单个基因，特别是一个只有失活时功能才会彰显的基因，似乎是一件不可能完成的任务。设备完善的大型专业实验室，包括韦伯斯特·卡夫尼（Webster Cavenee）在辛辛那提的实验室、布伦达·加利（BrendaGallie）在多伦多的实验室和温伯格在波士顿的实验室，都在疯狂地寻找能分离Rb的方法。但是，这些努力都陷入了停滞。温伯格回忆：“我们知道Rb住在哪里，但是我们不知道Rb是什么。”

　　从温伯格的实验室穿过查尔斯河，由眼科医师转行的遗传学家萨德·德里亚（Thad Dryja）也加入了对Rb的搜寻。德里亚的实验室位于麻省医院眼耳科六楼。这家眼科医院以眼疾的临床研究而著名，被当地的医界同行戏称为“眼球”。但它在实验室的研究上却没什么名气。温伯格的怀特黑德研究所拥有最先进的技术力量，包括可以测定成千上万DNA样品序列的机器，还有可以深入细胞核心的高倍荧光显微镜。而“眼球医院”则与之形成了强烈的反差：它还骄傲于在涂漆的木橱窗里展示19世纪的眼镜和镜片，放任自流地落在了时代的后面。

　　同样，德里亚也不像是一位癌症遗传学家。80年代中期，他结束了在波士顿医院眼科的临床研究后，就到小镇另一头的儿童医院科学实验室研究眼疾的遗传。作为一名对癌症有兴趣的眼科医师，德里亚有一个明确的目标：成视网膜细胞瘤。但即使这位根深蒂固的乐观主义者在考虑搜寻Rb的时侯也犹豫不决。“布伦达·加利和韦伯斯特·卡夫尼都停止了他们（克隆Rb）的尝试。这是一段缓慢的、令人沮丧的时光。”

　　德里亚带着一些关键性的假设开始寻找Rb。他知道，正常人类细胞每条染色体有两个副本（除了性染色体），分别来自父亲和母亲，总共有23对染色体，总数是46条。因此，每个正常细胞都有两个Rb基因的副本，分别位于第13号染色体的两个副本上。

　　假设克努森的“二次突变假说”是正确的，那么每一个眼部肿瘤应该在Rb基因上发生两次独立的失活性突变，每条染色体上分别发生一次。德里亚知道突变有很多种形式，可能是激活基因的DNA发生微小的改变，也可能是基因上巨大的结构缺失，延伸到染色体的很长一段。既然必定是Rb基因失活而引发成视网膜细胞瘤，因此德里亚推断：负责此事的突变很可能是一次基因删除事件。毕竟，要使基因瘫痪并失活，删除一大段可能是最快、最原始的方式。

　　德里亚怀疑，在大部分成视网膜细胞瘤中，Rb基因两个副本的两次缺失位于基因的不同部分。由于突变是随机发生的，两次突变恰恰位于基因同一区域的概率，类似于掷有一百个面的骰子出现两次六点一样难。通常其中一种缺失会“打击”基因的前端，而另一种可能“打击”后端（不管哪种情况，作用的结果是相同的——使Rb失活）。因此在大部分肿瘤中，这两次“打击”是不对称的，影响的是两条染色体上基因的两个不同部位。

　　但是，即使是百面的骰子被掷了很多次后，也会连续出现两次六点。德里亚认为很少会碰到一种肿瘤，两次突变恰好都删除了两条姐妹染色单体上基因的相同部分。如果发生这种情况，这段染色体会在细胞中完全缺失。如果德里亚能找到一种方法，可以鉴定成视网膜细胞瘤细胞中第13号染色体上完全消失的片段，他就能马上登陆Rb基因。这是最简单的战略：要找到功能缺失的基因，德里亚就要寻找结构上的缺位。

　　为了识别出这样一种缺失的片段，德里亚需要13号染色体的结构标记——被称为探针的小段DNA，沿着染色体的长度排成一条线。他可以利用瓦缪斯和毕晓普在20世纪70年代用过的“黏附”反应，对之稍作改动，运用这些DNA探针去探究：如果肿瘤细胞中存在DNA片段，它就会黏附；如果片段不存在，DNA探针就不会黏附，从而鉴定出细胞中缺失的片段。德里亚已经收集了一系列这种探针，但更需要的是他独有的资源：一个大型冷冻肿瘤储藏库。在两条染色体的Rb基因中找到一种共有的缺失，机会渺茫，所以他必须在大量的样品集合中测试，才可能找出一个。

　　这正是德里亚对抗多伦多和休斯敦的大型专业实验室所具有的优势。实验室的科学家很少会冒险去实验室外寻找人体样本。临床医生德里亚，则有满满一冰箱的样品。他带着收藏家那种童稚的欢喜说：“我着迷似地收藏肿瘤，在病人和医生中散布正在寻找成视网膜细胞瘤病例的消息。每当出现一个病例就会有人说‘把德里亚那个家伙叫来’，然后我就会开车或者坐飞机，甚至走路去拿样品，把它们带到这儿。我甚至记住了病人的名字。由于这种病在家族中出现，我会去他家拜访询问是否有兄弟姐妹或表亲患有成视网膜细胞瘤。有时，我甚至比医生还先知道（他们患有肿瘤）。”

　　德里亚周复一周地从肿瘤中提取染色体，然后在染色体中使用探针装置进行搜寻。如果探针结合了，它们通常会在胶质上发出信号；如果探针未找到目标，信号就是空白的。一天早上，德里亚来到实验室，把先前十几个筛选过的肿瘤印迹板对着窗户，从左到右一条条机械地看过去，就像一位读谱的钢琴家。突然，他在一个肿瘤中看到了一个空白区。他称为H3-8的探针在那个肿瘤的两条染色体中都缺失了。他感到一阵狂喜，但瞬间又陷入不安。“就在那一刻，我有了一种感觉，基因已经胜券在握。我已经在成视网膜细胞瘤上成功登陆。”

　　德里亚已经找到了肿瘤细胞中所缺失的一段DNA。现在，他需要在正常细胞中找到相对应的片段，从而分离出Rb基因。越接近尾声，越充满危险，德里亚就像一位处在极限的特技演员一样。他那只有一间房的实验室里，紧张的弦绷到了极致。他的基因分离技巧不足，资源有限。要分离这段基因，他需要寻求帮助，所以他又做了另一次冒险。他听说温伯格实验室的研究员也在寻找成视网膜细胞瘤基因。显而易见，此时他面临两个选择：要么与温伯格合作，要么尝试独自分离这个基因，然后完全输掉这场比赛。

　　温伯格实验室中设法分离Rb的科学家是史蒂夫·弗兰德（SteveFriend）。他是一位天性快乐、有专业造诣的分子遗传学家，聪明透顶且平易近人。曾经有朋友在聚会上随口向德里亚提起过他对Rb的兴趣。德里亚有日益充盈的肿瘤样品库藏可供研究；与他不同的是，弗兰德收集了一批正常细胞——Rb基因完整无缺。弗兰德的方法是找到存在于正常视网膜细胞中的基因，然后试着鉴定那些在成视网膜细胞瘤中的异常基因。这恰是与德里亚相对的逆向研究。

　　对德里亚来言，这两种途径的互补性显而易见。他已经鉴定出肿瘤中缺少的一段DNA。那么弗兰德和温伯格现在能把完好无缺保持全貌的基因从正常细胞中拉出来吗？他们规划了两个实验室可能的合作方案。1985年的一个早晨，德里亚亲手攥着他的探针H3-8，几乎是一路跑过朗费罗大桥（如今这座桥已经成为癌形成研究的康庄大道），奔向弗兰德位于怀特黑德的实验室。

　　弗兰德做了一个快速实验来检测德里亚的探针。他再次利用了DNA的“黏附”反应，捕获并分离出附着于H3-8探针的正常细胞的基因。不出所料，分离出的基因“生活”在第13号染色体上。当德里亚在他的肿瘤样品储藏库中进一步测验候选基因时，发现了完全符合克努森十多年前所假设的事实：成视网膜细胞瘤细胞的两个基因副本都发生了失活——两次打击，而正常细胞基因则含有两个正常副本。弗兰德分离出的候选基因无可争议地就是Rb。

　　1986年10月，弗兰德、温伯格和德里亚在《自然》上发表了他们的结论。这篇文章是对温伯格RAS论文阴阳之说的完美补充，分离了激活的原癌基因（RAS）和鉴定出抑癌基因（Rb）。温伯格写道：“十五年前，克努森表明至少需要两个遗传事件才能引发肿瘤的形成，从而为研究成视网膜细胞瘤的肿瘤形成提供了理论基础。我们已经分离出明显可以代表这类肿瘤抑制基因之一的（人类基因）。”

　　Rb在正常细胞中做什么仍然是一个未解之谜。人们发现，Rb的名字完全是一个误称。Rb（成视网膜细胞瘤基因）不仅在罕见的儿童眼部肿瘤里发生突变。90年代初期，科学家在其他癌症检测上测试德里亚、弗兰德和温伯格所分离出的基因时，发现Rb在成年人的肺部、骨骼、食道、乳房和膀胱癌中广泛地产生突变。Rb像RAS一样，几乎出现在每一个分裂的细胞中，而且它在大量的恶性肿瘤中失活，因此，称其为“成视网膜细胞瘤基因”极大地低估了这个基因的影响力、深度和威力。

　　“成视网膜细胞瘤基因”编码一种同名的Rb蛋白质，它有一个很深的分子“袋”，主要作用是连接一些其他的蛋白，然后把它们紧紧地密封在那个袋子里，防止它们激活细胞分裂。当细胞决定分裂时，它会给Rb加上磷酸基团标签（一种可以使基因失活的分子信号），然后迫使蛋白质释放它的伙伴。因此Rb充当了细胞分裂的守门人，每次细胞分裂被激活时，它就打开一连串重要的分子闸门，当细胞分裂完成时再立刻关闭它们。但Rb的突变钝化了这种功能，致使癌细胞感知其闸门永久开启，因此持续分裂。

　　对RAS和Rb这两个致癌基因和抑癌基因的克隆，是癌症遗传学上扭转乾坤的时刻。1983年到1993的十年间，在人类癌症中许多其他致癌基因和抑癌基因（肿瘤抑制基因）很快被鉴别出来：myc、neu、fos、ret、akt（都是致癌基因），和p53、VHI、APC（都是肿瘤抑制基因）。致癌基因的偶然载体逆转录病毒被抛到九霄云外。人们认识到，瓦缪斯和毕晓普关于致癌基因是被激活的细胞基因的理论，对许多形式的癌症是广泛正确的。而且二次突变假说，也就是肿瘤抑制基因是两条染色体都需失活的基因这一假说，也被证实在癌症中是普遍适用的。癌发生的一个通用理论框架逐渐清晰起来。癌细胞是破损、失常的机器。致癌基因是卡住的油门，而失活的癌症抑制基因则是失灵的刹车④。

　　20世纪80年代晚期，另外一系列过去的研究起死回生，进一步发现了与癌症相关的基因。从1872年德·戈维亚报道巴西家族眼部肿瘤开始到现在，遗传学家又发现了一些疑似携带癌症基因的家族。这些家族的故事承载着一个熟悉而悲惨的魔咒：癌症世代纠缠着他们，在父母子孙中一再出现。在这些家族史里有两个很突出的特点。首先，遗传学家发现每个家庭的癌症类型是有限的，而且往往是一成不变的：结肠癌和卵巢癌会在某一家族呈现家族性遗传；乳腺癌和卵巢癌则在另一个家族中遗传；恶性毒瘤、白血病和神经胶质瘤会在其他家庭中遗传。其次，相似的形式常常在不同的家族中再现，说明有共同的遗传综合征。在林奇综合征⑤家族，代代都会一再出现结肠癌、卵巢癌、胃癌和胆癌。在佛美尼综合征家族，则有反复发生的骨骼和内脏的恶性肿瘤、白血病和脑瘤。

　　20世纪80年代和90年代，癌症遗传学家运用强大的分子遗传学技术，克隆并鉴定出一些与癌症相关的基因。这些家族性的癌基因中，有很多是肿瘤抑制基因，如Rb，尽管偶尔也会发现致癌基因。大多数这种综合征候群十分罕见。但偶尔遗传学家也会发现癌症易感基因的改变在一般人群中十分常见。这当中最惊人的可能就是BRCA-1，这种基因使人有强烈地倾向患上乳腺癌和卵巢癌，它是由遗传学家玛丽·克莱尔·金（Mary Claire-King）首先提出的，然后最终由马克·什科尔尼克（MarkSkolnick）团队在麦利亚德基因科技制药公司（Myriad Genetics）克隆出来。在选中的人群中，高达1%的妇女有BRCA-1（我们会在后面文章中提到），使之成为已发现在人类身上最常见的癌症相关基因之一。

　　到90年代早期，癌症生物学的这些发现终于跨越了裴顿·劳斯的鸡肿瘤和真正的人类癌症之间的鸿沟。但是，纯粹主义者仍在抱怨。罗伯特·科赫那执拗的幽灵仍然纠缠着癌症的遗传理论。科赫制定的法则提出，一种作用物要被确定为某一疾病的“病因”，它必须符合三个条件：（1）存在于患病的有机体内；（2）可以从患病有机体中被分离出来；（3）当从患病有机体中被转移到第二个宿主时，可以重新形成疾病。致癌基因已经具备了前两个条件，它们存在于癌细胞，而且可以从癌细胞中被分离出来，但还没有人证明癌基因本身能自行制造出动物体内的癌症。

　　20世纪80年代中期，癌症遗传学家做了一系列卓越的实验达到了科赫的最终标准。1984年，研究干细胞的生物学家发明了一种新技术，可以向早期小鼠胚胎中引入外源性基因，然后由这些改造过的胚胎生出活的小鼠。这使他们制造出“转基因小鼠”，就是有一个或多个基因被人为地永久修改了的小鼠。癌症遗传学家抓住了这个机会。首先转移到老鼠体内的基因包括一种在淋巴癌细胞中发现的致癌基因c-myc。

　　哈佛大学的菲利普·莱德（Philip Leder）团队通过运用转基因小鼠技术，改变了小鼠的c-myc基因，但他们做了一点调整：他们很聪明地确保了该基因只在小鼠的乳腺组织里过度表达。（myc不能在所有的细胞中都被激活。如果myc在胚胎中被永久激活，胚胎会变成一个过度增生的细胞球，因未知的机制纠结而死。活鼠中激活myc的唯一方法就是把活化作用限制在只能发生在一个细胞子集中。因为莱德的实验室正在研究乳腺癌，所以他选择了乳腺细胞。）莱德用通俗的语言把他的小鼠称为肿瘤鼠（OncoMouse）。1988年，他成功地申请了肿瘤鼠的专利，使它成为历史上第一种获专利保护的动物。

　　莱德预测他的转基因老鼠会突发癌症，但令他惊奇的是，肿瘤鼠只萌发了相当“微小”的癌症。尽管已经在小鼠的染色体中植入了很凶猛的致癌基因，可是它们只形成了很小的单侧乳腺癌，而且是直到生命晚期才出现的。更出人意料的是，莱德的小鼠通常只在怀孕后生成癌症，表明乳腺细胞实现完全转化严格依赖激素等的环境影响。莱德写道：“活跃的myc基因似乎并不足以导致发展出这些肿瘤。否则，我们应该看到五只小鼠全部长出两侧的（乳腺）腺体的肿瘤。然而，我们的结果显示至少还需要另外两个条件。其中一个可能是更进一步的转化事件；另一个初步研究显示似乎是一个与怀孕相关的激素环境。”

　　为了检测其他致癌基因和环境刺激的作用，莱德创造了第二种肿瘤鼠。在这种鼠体内，两种激活的原癌基因RAS和myc被植入染色体内，在乳腺细胞中被表达。几个月内，多发性肿瘤在这些老鼠的乳腺中萌发起来，对怀孕的激素环境的要求有所降低。但只有一些明显的癌症克隆在RAS-myc小鼠中出现。每只小鼠都有数百万的乳腺细胞具有激活的RAS和myc，那些数百万的细胞每一个都被赋予了最强力的致癌基因，却只有几十个变成了真正的、存活的肿瘤。

　　即便如此，这仍然是一个里程碑式的实验：在一种动物身上，人为地制造了癌症。正如遗传学家克利夫·塔宾（CliffTabin）的回忆：“癌症遗传学已经跨入了一个新境界。它不只是在实验室里探究基因、通路和人造肿块，而是动物体内真正生长的肿瘤。”裴顿·劳斯长久以来对癌症原理的斥责之声——癌症从未通过改变一组特定的细胞基因而在活的生物体中产生，终于永远地平息了。

　　①事实上，温伯格使用的“正常”细胞并不是完全正常的。它们已经被改变得适应生长，因此只要一个激活的致癌基因就能使它们完全进入转变后的生长。温伯格后来发现，真正的“正常细胞”需要几个基因突变才能发生转变。

　　②事实上，像src一样，早些时候RAS也已经在致癌病毒中被发现。这再次强调了这些病毒在揭示内源致癌基因机理方面的惊人能力。

　　③1971年《国家癌症法案》颁布之后，拉斯克派在很大程度上被解散了。玛丽·拉斯克仍然涉足科学政策，但是已经不再如60年代那样掌控呼风唤雨的力量和能量。

　　④管癌症并非都是由病毒引起的，但某些病毒会引起特殊的癌症，比如人乳头状瘤病毒（HPV）会引起宫颈癌。20世纪90年代驱动癌症的机理被解开后，结果证明HPV是使 Rb和p53失活的信号，这也强调了即使是在病毒引发的癌症中，内源性基因也很重要。

　　⑤由肿瘤学家亨利·林奇（Henry Lynch）率先在一个内布拉斯加的家族中描述出这种综合征。

　　（编辑：tspsy-欣欣 | 来源：）

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